故事發生在抗日戰爭時期。因軍統諜網連遭日特破壞，戴笠（王崗 飾）從集中營選出因故做牢的陳一鳴（庹宗華 飾）少校，令他組建“眼鏡蛇”特工小組，暗殺日特駐華頭子中村一郎（于震 飾），領命后陳一鳴即刻招募各路高人進行培訓。這時，美軍上校梅樂斯找到戴笠，要他設法營救被中村逮捕的美特工史密斯夫婦。中共高級特工黃天明（侯勇 飾）得到南京黃云睛（吳曉敏 飾）送來的情報，他奉上級指示，將史密斯夫婦所在位置故意泄露給軍統南京站高站長，陳一鳴帶著特工小組出發了。他們化裝混入醫院，先救出了史密斯夫婦，然后執行此次來的首要任務：刺殺中村一郎，他們能順利完成任務嗎……

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